Před experimentem by měla být všechna činidla a vzorky vyváženy na pokojovou teplotu; po přetavení by se vzorky měly znovu odstředit a odebrat supernatant k testování; pro reagencie nebo přípravu vzorků promíchejte a vyhněte se pěnění; kalibrace a vzorky se doporučují pro duplicitní testování.

1. Přidejte ple: postupně přidejte standardní pracovní roztok do prvních dvou jamek a přidejte dva otvory pro každou koncentraci pracovního roztoku, 100 μ L každé jamky. Vzorky, které mají být testovány, jsou přidány do dalších jamek, 100 μ L na jamku (pro koncentraci vzorku nad testovací rozsah, vzorek naředěný standardem a ředění vzorků). Mikrodestička byla potažena filmem a inkubována při 37 °C ℃ po dobu 90 min. Tip: Při přidávání vzorku na dno mikrodestičky se snažte nedotýkat stěny otvoru, jemně protřepejte a promíchejte, abyste zabránili tvorbě bublin. Dodatečný čas by měl být řízen do 10 minut.

2. Biotinylovaná protilátka/antigen: zlikvidujte kapalinu a protřepejte dosucha, bez promytí. 100 μl pracovního roztoku biotinylované protilátky/antigenu bylo okamžitě přidáno do každé jamky, promícháno, mikrotitrační destička plus potaženo filmem a inkubováno při 37 °C po dobu 1 hodiny.

3. Promývání: protřepejte kapalinu v otvoru, přidejte 350 μl promývací kapaliny do každé jamky, namočte 1-2 minuty, odsajte nebo setřeste kapalinu v mikrotitrační destičce a osušte na silném sacím papíru. Tento krok promývání destičky opakujte 3krát. Tip: Pračku lze použít zde i v dalších pracích krocích. Každý krok mytí je pro experiment nezbytný.

4. Konjugát enzymu HRP: 100 μ 1 pracovního roztoku enzymového konjugátu na jamku, smíchaný, potažený filmem a inkubován při 37 °C ℃ po dobu 30 minut.

5. Promývání: vylijte kapalinu do jamky a promyjte destičku 5krát stejným způsobem jako v kroku 3.

6. Substrát: do každé jamky přidejte 90 μl roztoku substrátu (TMB), dobře promíchejte, přidejte filmový povlak a inkubujte při 37 °C po dobu asi 15 minut. Poznámka: Doba inkubace by měla být zkrácena nebo prodloužena podle aktuální situace vývoje barvy, ale ne více než 30 minut. Může být ukončen, když se ve standardní díře objeví jasný přechod.

7. Ukončení: Přidejte 50 μ 1 ukončovacího roztoku do každé jamky pro ukončení reakce. Poznámka: Pořadí přidávání ukončovacího roztoku by mělo být stejné jako u roztoku substrátu.

8. Odečtěte: Okamžitě změřte optickou hustotu (OD) každé jamky při 450 nm pomocí čtečky mikrodestiček. Před nastavením testovací procedury by měla být čtečka mikrodestiček otevřena.

9. Po ukončení experimentu vložte nespotřebované činidlo zpět do chladničky podle uvedené skladovací teploty do doby použitelnosti.